20222月28日，传奇生物CAR-T细胞产品CARVYKTI（ciltacabtagene autoleucel）获得FDA批准已成为美国上市的第六个CAR-T药物。

2022年3月15日，FDA颁布《Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products》草案，目的是为了CMC(化学、生产和控制)、临床前(药理学和毒理学)和临床研究设计CAR T细胞产品建议，虽然该指南是专门针对的CAR T细胞产品，但许多信息和建议也适用于其他转基因淋巴细胞产品，如自然杀伤（NK）细胞或T细胞受体（TCR）修饰的T细胞。

CAR T细胞产品的临床前评估是支持产品在临床研究中应用的合理和安全的结论。由于产品类型固有的生物复杂性和可变性，以及可用于测试安全性和活性的合适动物模型的有限性，CAR T细胞产品的临床前测试可能是一个挑战。体内、体外、计算机应酌情使用模拟测试策略，结合相关产品的临床和临床前数据，应用case-by-case支持拟议临床试验的临床前试验策略。

2013年11月FDA颁布的《Preclinical Assessment of Investigational Cellular and Gene Therapy Products》描述了如何对细胞和基因治疗产品进行临床前研究，本次提出了以下四个方面CAR T临床研究建议。

A.对CAR T临床前考虑细胞载体成分

CAR载体的设计和转基因的传递T细胞的过程对决定产品的安全性和活性至关重要。CAR遗传物质通过各种载体类型传递给T细胞，包括γ-逆转录病毒和慢性病毒载体mRNA。

CAR T细胞安全性和有效性的主要决定因素之一是具有靶特异性的抗原识别域。抗原识别域可能来自单克隆抗体（mAb）、内源性配体/受体对或其他来源。抗原识别领域的临床前评估应包括对靶抗原特异性和亲和力的评估，以评估靶向/非靶向肿瘤和非靶向毒性的可能性。通过体外和体内研究，可以评估预期靶抗原的健康/正常组织(靶向/非肿瘤)的非预期靶向，以及健康/正常组织表达的其他抗原的非预期靶向。例如:(1)使用具有相同抗原识别领域的单克隆抗体或融合蛋白进行组织交叉反应研究；(2)对各种器官/组织的人类原代细胞、细胞系统和诱导多能干细胞衍生系统进行细胞毒性测试；(3)蛋白质阵列；(4)相关动物模型。FDA建议包括以前具有相同抗原识别域的建议CAR或者单克隆抗体（如适用）临床经验中的信息，可以减少或消除额外特异性和亲和力测试的建议。鼓励申请人探索各种方法的组合，以最大限度地降低研究对象的风险，并为临床试验设计提供信息。确定潜在的脱靶活动对于制定入组标准和特定的输液后评估和监测计划非常重要。

还建议测量目标抗原的表征。目前靶抗原的临床经验和组织表达谱可以提供研究CAR T支持细胞潜在肿瘤外靶点的信息。然而，如果识别域不同，则针对与以前不同的区域。CAR T细胞相同抗原的抗原识别域可能有不同的安全性和不同的毒性风险。不同的抗原识别域可能对靶点有不同的亲和力，或抗原上的不同位点，应在临床前进行评估。此外，由于产品之间的固有差异（例如，CAR T细胞运输、扩增、产生细胞因子、诱导细胞毒性和持久性的能力)，利用相同单链可变片段（scFv）的CAR T细胞和单克隆抗体的安全性可能不同。

多种整合到CAR T细胞中的激活和共刺激结构，包括CD3ζ链、4-1BB（CD137）、CD28和CD40。这些领域已被用于各种组合。根据细胞类型，刺激结构领域的某些组合会导致不同的生物特性，如独特的细胞因子分泌谱。这可能会影响体内细胞的扩张、持久性和其他免疫细胞类型的激活。解决方案CAR T临床前评估的一个重要方面是细胞不依赖细胞因子生长和不受控制的增殖。CAR T细胞分泌细胞因子和介导细胞溶解的能力应受到抗原依赖的限制，这可以通过暴露在不同的细胞中来测试，这在靶抗原的表达上是不同的。跨膜区和铰链区也会受到影响CAR T细胞的安全性和活性。这些区域可以通过影响抗原识别区域的灵活性和靶外激活来改变靶活性。抗原依赖性和抗原非依赖性活性可以通过体外和体内测试来评价，从而对这些产品的特性进行综合评价和表征。

B.对CAR T临床前考虑细胞成分

表达CAR转染细胞的性质也会影响最终试验药物的生物活性。用于表达。CAR的各种T细胞组包括：（1）纯化T(2)含有其他污染细胞(如其他污染细胞(如)NK细胞、B细胞等。)没有选择T(3)病毒抗原特异性T细胞(如巨细胞病毒病毒)（CMV）、EB病毒（EBV））；(4)选择干细胞样或年轻T细胞。不受控制的增殖和毒性潜力可能因细胞来源而异。因此，临床前评估可能包括检测细胞因子的非依赖性细胞生长、体外和体内T细胞克隆测试、核分析、TCR病毒抗原的特异性是通过体外刺激和识别来检测的。

T细胞可以是自体或来自同一异体。对于异基因。CAR T细胞，FDA建议提供解决方案等数据CAR T移植物抗宿主反应或宿主排斥反应(如混合淋巴细胞反应、HLA分类)的可能性和其他问题。如果使用基因组编辑技术来减少同一异体反应，可能需要额外的临床试验。

C.CAR T体内细胞试验

可用于动物模型CAR T细胞功能的概念验证。CAR T细胞和肿瘤靶点的物种特异性、异种移植物的抗宿主反应以及在动物中模拟人类免疫反应的困难都有一些局限性。尽管存在这些局限性，但在小鼠异种移植模型中(即使用人类)CAR T人类肿瘤异种移植小鼠模型)体内试验可提供相关CAR T细胞运输和增殖特征信息。

图1：异种移植小鼠用于患者来源CAR T细胞评估

图1来自Humanized Mice Are Precious Tools for Preclinical Evaluation of CAR T and CAR NK Cell Therapies[J]. Cancers,2020,12(7)

如果可以使用相关的替代产品，可以提供相关的替代基因肿瘤动物模型CAR T细胞与完整宿主免疫系统相互作用的信息，以及潜在的靶向/非靶向肿瘤毒性。应提供支持模型适用性的数据，如抗原识别域对人类靶点和动物靶点的结合亲和力，以及评估物种中靶向抗原的表达谱。CAR T细胞行为的表征，如靶向依赖性激活和增殖，以及抗肿瘤反应（如肿瘤大小和动物存活率），可以为人类产品测试提供支持依据。

由于CAR T细胞的性质预计在体内会有不同程度的扩张，因此初始剂量水平的选择通常不完全基于动物研究。过去类似的使用CAR T细胞的临床经验通常可以告知研究人群的初始剂量水平、剂量增加计划和给药方案。

D.经过额外修改CAR T细胞

CAR T细胞可以包含转基因中的其他成分，如自杀基因、检测/选择基因或免疫调节元件。基因编辑或基因沉默技术也可用于修改CAR T为了降低免疫原性(例如，对于同一异体，CAR T细胞)或增加活性或持久性。为了评估特定成分的功能和测试产品的安全性，可能需要对新的辅助分子和基因修饰进行额外的临床前试验。例如，混合淋巴细胞反应可能有助于评估和修饰以减少GVHD风险产品的免疫原性和对同一异体产品的免疫反应。CAR T通过非细胞因子生长分析或适当设计的体内研究，可以评估细胞持久性的其他修饰。当添加自杀基因时，FDA建议进行临床前研究，证明其功能，确定诱导CAR T任何额外药物或生物制剂的剂量对细胞耗尽至关重要。

定义CAR T细胞安全和活性的参数是多因素的。考虑因素包括：（1）载体结构的设计（如抗原识别结构、信号结构、跨膜结构和铰链结构）；（2）载体传输方法；（3）细胞来源；（4）操作过程（如激活、细胞选择）；（5）生物活性（如细胞因子表达谱、细胞毒性、增殖）；（6）添加新成分（如自杀基因、免疫调节元件）。综合临床前测试计划应采用多种测试策略的组合。这些信息，以及相关产品的临床前和临床数据，可以为临床试验设计提供信息，并支持研究CAR T细胞进行人体试验。

2021年11月底，我国颁布了《基因修饰细胞治疗产品非临床研究技术指导原则（试行）》，讨论了基因修饰细胞治疗产品的非临床有效性和概念验证、药代动力学、转基因表达产品和插入式突变风险评估CAR或TCR修改后的免疫细胞应尽可能多地评估靶点相关毒性和脱靶毒性的风险。这一次，免疫细胞应尽可能多地评估靶点相关毒性和脱靶毒性。FDA的《CAR-T《细胞产品开发考虑》指南进一步细化了临床前需要开展的评价项目，为临床前药理毒理学研究提供指导和规范。